Микробиологическая диагностика микозов Микроскопическое исследование
Микроскопия – это один из основных методов в лабораторной диагностике микозов. Проводить это исследование необходимо с того дня, когда на питательной среде появляются первые колонии. Перед микроскопическим исследованием необходимо знать является гриб дрожжевым или плесневым – по внешнему виду колоний, результатам проростковой пробы.
При микроскопии плесневых грибов учитывают структуру мицеллия (т.е. особенности строения гиф, их цвет, септированность; особенности строения конидиев и спор, включая размер, форму, цвет конидиев; строение их клеточной стенки, септированность и т.д.)
Для проведения микроскопии готовят нативные и окрашенные препараты. Для приготовления окрашенных препаратов материал обрабатывают различными способами:
1. Окраска PAS-методом. Использование РAS-метода позволяет выявить нейтральные полисахариды в стенках микроорганизмов. Нейтральные полисахариды – это глюкан-маннановый комплекс, находящийся в клеточной стенке большинства эумицетов, за счет него и происходит окрашивание.
PAS-реакции – один из методов микроскопической диагностики тканевых форм грибковой инфекции. В практических лабораториях для микроскопической диагностики используются различные модификации этого метода: окисление хромовой кислоты – реакция Бауэра; окраска по Гридли.
2. Окраска по методу Грама (модификация по Грам-Вайгерту) для выявления сопутствующих микроорганизмов.
3. Окраска по Циль-Нильсону для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов. Если исследуемый материал жидкий, то из него готовят неокрашенный мазок для микроскопии в просветляющих жидкостях: смесь спирта с глицерином в соотношении 1:1.
Следующий этап это микологическое исследование – выделение и идентификация грибов. Рассмотрим особенности этого этапа в зависимости от исследуемого материала.
Микологическое исследование
Культуральное исследование. Культуральное исследование основано на выделение возбудителя из исследуемого материала. Сроки культивирования различны для разных видов грибов (от 2-4 дней до 4 недель), при подозрении на диморфные грибы культуру выделяют до 8 недель. Основными средами для культивирования в микологической лаборатории является среда Сабуро: декстрозный агар Сабуро (плотная среда), бульон Сабуро (жидкая среда). Для подавления роста бактериальной флоры в среду Сабуро добавляют антибиотики (хлорамфеникол, гентамицин, реже стрептомицин, пенициллин). Для подавления роста сапрофитных грибов в среду добавляют циклогексимид, хлорамфеникол. Существуют готовые среды с циклогексимидом (Mycobiotic Mycosel).
Оптимальным режимом культивирования для большинства патогенных грибов является 30 0 С, 20-25 0 С, реже 37 0 С – при подозрении на диморфные грибы. Длительность инкубации для большинства грибов составляет до 6 недель; если по прошествию этого времени роста не наблюдается, то дают отрицательный ответ. В случае подозрения на диморфный микоз при отсутствии роста в течение 6 недель, культуру выдерживают 8 недель и только после этого дают отрицательный результат.
При культуральном исследовании диагностически значимымявляются:
— выделение плесневого или дрожжевого гриба, при исследовании стерильного в норме материала;
— выделение диморфного гриба.
Алгоритм микологического исследования
1. Определение грибковой этиологии возбудителя (микроскопия).
2. Определяют дрожжевой гриб или плесневый:
— микроскопия клинического материала (наличия мицеллия);
— характер колоний на питательной среде, скорость роста (дрожжевые грибы растут 48 часов, плесневые грибы растут медленно).
3. Окончательную идентификацию гриба до уровня вида (внутривидовая) проводят с использованием биохимических тестов и иммунологических методов. При исследовании биохимических свойств изучают способность выделенной культуры к ассимиляции (ауксанограмма) и ферментации (зигограмма). Возможно использование автоматизированных систем идентификации (тест-системы для идентификации грибов).
Критерии этиологической значимости выделения условно-патогенных грибов
1.Если в нативном препарате видны только бластоспоры (сапрофитная вегетация) то это расценивается как носительство.
2.Если в нативном препарате преобладают бластоспоры и появляются единичные нити псевдомицелия, то это сигнал о переходе гриба к паразитизму.
3.Если бластоспоры единичные и преобладает псевдомицелий, то это признак глубоких органных поражений.
4.Активное почкование бластоспор – свидетельство острого процесса.
5.Количественную оценку результатов – выделение гриба из разведений
6.Повторность высеваемости одного и тогоже вида гриба
7. Наличие антител к выделенному штамму.
Микологическое исследование отделяемого слизистых
1. Подготовка материала. После забора материала со слизистых тампон помещают в 2 мл жидкой среды Сабуро или сусло-агара, или МПБ, разлитого в стерильные пробирки. Их тщательно встряхивают в течение 5 минут, стараясь не замочить пробку. Из полученной взвеси готовят ряд разведений 1:10 и 1:100 и т.д.
2. Культуральное исследование.
Из каждого разведения высевают по 0,1мл на 2 чашки сусло-агара, агара Сабуро или МПА. Посевы на плотных средах и пробирку с жидкой средой с тампоном для обогащения инкубируют при +37 0 С в течение 48 часов:
— после пройденного времени посевы просматривают и подсчитывают число колоний и ориентировочно определяют количество дрожжевых колоний. Их количество умножают на 20 и на разведение, из которого сделан высев;
— если на чашках с посевом, сделанным из разведений роста нет, то делают повторный посев из среды обогащения в чашку с сусло-агаром.
Микологическое исследование крови
1. Подготовка материала. После забора крови ее разводят 1:10, для того, чтобы бактерицидные свойства крови не ингибировали рост грибов.
2. Культуральное исследование.
— 5-10мл крови засевают в 50-100 мл жидкой среды Сабуро с 2% глюкозой. При температуре 37 0 С их инкубируют в течение недели;
— через 5 дней делают контрольный высев. Для этого стерильной пипеткой забирают осадок 3-4 капли из пипетки засевают на сусло-агар и растирают стерильной бактериологической петлей;
— засеянные чашки в течение 2-5 дней держат в термостате при 37 0 С;
— если обнаружен рост, то выдают предварительный ответ о фунгемии, а дальнейшую идентификацию гриба проводят в ходе исследования.
Микологическое исследование биоптатов
1.Для забора материала используют метод отпечатков.
2. Культуральное исследование:
— делают отпечаток исследуемым кусочком ткани на поверхность плотной питательной среды Сабуро;
— этот же кусочек ткани помещают в 50мл жидкой питательной среды (сусло или Сабуро);
— посевы инкубируют при 37 0 С в течение 5 дней.
Источник
Диагностика микозов
Патогенные грибки разных родов и семейств сильно отличаются друг от друга по своим свойствам.
А вот клиническую картину и симптоматику заболеваний, которые они вызывают, различить бывает сложно.
Чтоб назначаемое лечение было патогномоничным и эффективным, необходима лабораторная диагностика микозов, без которой невозможно идентифицировать возбудителя.
Чтоб сделать вывод о природе грибка, его необходимо как минимум увидеть в микроскоп.
Ценную информацию предоставляет оценка роста на питательных средах.
Наиболее продвинутые методы даже позволяют сделать генетический анализ грибка.
О методах диагностики микозов
рассказывает подполковник
медицинской службы, врач
Ленкин Сергей Геннадьевич
Содержание данной статьи проверено и подтверждено на соответствие медицинским
стандартам врачем дерматовенерологом, урологом, к.м.н.
Ленкиным Сергеем Геннадьевичем
| Наименование | Срок | Цена |
|---|---|---|
| Микроскопическое исследование соскобов кожи | 2 д. | 600.00 руб. |
| посев на возбудителей грибков кожи и ногтей, без определения чувствительности к препаратам | 21 д. | 2500.00 руб. |
Методы диагностики микозов
Каждый из способов по-своему важен и ценен, поэтому в лабораторном деле находится применение всем методикам:
- I. Микроскопия образца (нативная или с предварительной фиксацией).
- II. Люминесцентная микроскопия.
- III. Культуральное исследование – посев материала на питательную среду.
- IV. Выявление антител к отдельным патогенным грибкам в сыворотке.
- V. Обнаружение специфических антигенов возбудителей в образце крови.
- VI. Гистологический анализ.
Как правило, диагностический процесс начинается от самого простого метода.
И только при неоднозначных результатах подключатся более продвинутые и дорогие способы.
Микроскопия
Практически всегда диагностика микозов начинается с попытки увидеть возбудителя.
Материалом для исследования служит фрагмент ткани из очага поражения:
- Волос.
- Соскоб с поверхности кожи.
- Капля гноя или экссудата.
- Подногтевая ткань.
- Корка.
Плотные образцы собирают просто на листик пергаментной бумаги.
Жидкость – при помощи шприца – в стерильную чашку Петри или пробирку.
Волосы, чешуйки и корки размягчают и обесцвечивают раствором щелочи.
Если нужно – дополнительно подкрашивают чернилами.
Затем помещают на предметное стекло, накрывают покровным стеклышком и смотрят в микроскопе.
Оценивается внешний вид, форма, цвет и расположение микроорганизмов в препарате, что позволяет узнать грибок «в лицо».
Крупные размеры возбудителей дают возможность не прибегать к иммерсионной микроскопии.
Люминесцентная микроскопия основана на том, что некоторые дерматофиты дают в ультрафиолете, пропущенном сквозь специальный фильтр, зеленое свечение.
Прекрасный способ, облегчающий диагностику и лечение микозов, благодаря простоте и возможности организовать контроль эффективности терапии.
Культуральный анализ
Отказываться от него нельзя даже при отрицательной микроскопии, так как посев обладает гораздо большей чувствительностью.
Суть в том, что образец из очага заболевания помещается в специальную питательную среду.
Благоприятные условия провоцируют грибок на интенсивный рост, что позволяет решать сразу несколько задач:
- Оценка возбудителя по внешним характеристикам колоний.
- Получение материала для микроскопии.
- Диагностика латентного носительства.
- Анализ стойкости возбудителя к лекарственным препаратам.
Также можно сделать вывод о некоторых важных биологических особенностях грибка.
Культивирование проводят в термостате при температурах от 22 до 30°С.
Недостатком является время, нужное для инкубации.
Это от 4 до 30 дней и нужда в подтверждающей культивации, которая необходима для получения чистой культуры.
Анализы крови
Сывороточные пробы применяются не только для выявления сифилиса.
Они используются в диагностике грибковых заболеваний, при которых получение образца представляет определенные сложности.
Такое характерно для системных инвазий и поражения внутренних органов.
Серологические методы диагностики микозов помогают сделать заключение о такой опасной инфекции, как аспергиллез.
Эти грибки образуют колонии в паренхиматозных органах (обычно – в легких).
И материал для микроскопии или культуры получить достаточно сложно.
В анализе крови ищут Aspergillus-специфические иммуноглобулины – IgE и IgG.
Проблема в том, что аспергиллы в норме могут сосуществовать с человеком.
Поэтому антитела к ним не всегда указывают на патологию.
Так что кроме характерных клинических проявлений, нужна еще и динамика титра антител, то есть повторные анализы.
С кандидами все проще: у здорового человека антител к ним в крови быть не должно.
Даже однократное обнаружение специфических иммуноглобулинов позволяет сделать уверенный диагностический вывод.
В связи с увеличением количества страдающих СПИДом людей, актуален такой метод диагностики, как выявление антигенов дрожжевых грибков.
Гистологический анализ
Некоторые рассматривают его как вспомогательное исследование.
В отличие от возможностей, которые предоставляет микробиологическая диагностика микозов, гистология не позволяет идентифицировать возбудителя.
Ее назначают для оценки активности патологических изменений, которые сопровождают грибковую инвазию.
Некоторые выводы можно сделать по характеру этих изменений:
- Активное воспаление по периферии волосяного фолликула характерно для Т. rubrum.
- Признаки иммунологической реакции будут найдены при поражениях, обусловленных грибами М. саnis, Т. tonsurans и Т. verrucosum.
- При фавусе можно рассмотреть в биоптате эпидермиса нити мицелия и споры грибка.
Наибольшая ценность гистологического исследования в том, что оно позволяет отдифференцировать неясные случаи, в которых есть основания предполагать онкологический процесс от «банальных» микозов.
Диагностика микозов: важность комплексного подхода
Вдумчивый читатель заметит, что каждая из методик в отдельности не может гарантировать оптимальный (точный, быстрый и недорогой по стоимости) результат.
В то же время, даже простая, на первый взгляд, диагностика микоза стоп, без лабораторных исследований будет всего лишь гипотезой, а не клиническим диагнозом.
Поэтому важно правильно комбинировать методики и сопоставлять полученные результаты с данными клинического обследования и объективного осмотра.
При подозрении на микоз обращайтесь к автору этой статьи – дерматологу, микологу в Москве с 15 летним опытом работы.
Источник